0.5mL超滤离心管

注意转速和加速度不可太快，否则直接损坏超滤膜。开始离心超滤(离心机预冷至4度)。不同离心机的转速rpm换算成g之后有所不同。离心机的加速度调至最低档，减小对膜的压力。在实际使用中，一般转速开的比说明书里的要低，这样可以延长离心管的使用寿命。

离心过程中注意是否发生蛋白沉淀，导致堵塞超滤离心管。若发生沉淀，要确定沉淀的具体原因，是蛋白浓度过高还是Buffer不合适;前者可用多根超滤管同时超滤，降低浓度的办法解决，后者的方法是换不同的Buffer，直到蛋白不发生沉淀为止。

前面几步用以浓缩蛋白，如果要换Buffer，在总蛋白液浓缩至1mL左右的时候，轻轻加入新Buffer再浓缩至1mL左右，连续三次，最后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定，一般不多于500μL，也有浓缩至200μL以内的情况。按照每次至少10倍左右的体积浓缩算，三次达到1000倍以上，基本上可以达到换buffer的目的。

取出最终蛋白浓缩液的操作在冰上操作，用200μL枪头取，轻轻顺着边缘插入枪头，轻轻吹打、混匀蛋白液，注意不要碰到超滤膜。然后吸取浓缩液，每次吸接近200μL，直到吸完。管底剩下的最后一点浓缩液不必吸取，否则难度太大，有可能损坏超滤膜。最后加入超纯水到超滤管中，没过超滤膜，防止膜失水变干。

倒出超滤管里的水，用超纯水轻轻润洗几次，再加入0.1M的NaOH溶液，室温放置20min，再离心10min。倒出残留的NaOH溶液，将管芯浸入超纯水的烧杯(1或2L)中,放置几个小时，再换新的水,放置几个小时，不断稀释NaOH浓度。50mL管和盖子用自来水洗，内壁再用超纯水洗干净。取出浸没的管芯，加至接近满的超纯水，50ml管也加满超纯水，将管芯慢慢放入50ml离心管，排出部分水，然后盖上盖子，放4°C保存，直到下次使用。