浏览数量： 0 作者： 本站编辑 发布时间： 2024-06-11 来源： 本站
质粒提取是分子生物学实验中常用的技术之一，尽管操作简单，但其背后的原理很多人并不完全了解。市面上常用的质粒提取试剂盒，通常通过加入不同的溶液（如溶液1、2、3），经过洗涤和洗脱步骤来提取纯净的质粒DNA。然而，每种溶液的成分及其在实验中所起的具体作用，仍然是许多人不熟悉的。
质粒提取实验原理
Principle
在细胞中，存在多种生物大分子，包括蛋白质、基因组DNA、质粒DNA和RNA。质粒提取的目标是从这些复杂的分子混合物中分离出纯净的质粒DNA，而避免其他大分子的干扰。为实现这一目标，需采用特定的方法分别处理这些不同的分子。
基因组DNA与质粒
Distinguish
细菌没有细胞核，只有一个拟核，DNA是环状的，但是并非裸露的，上面结合有多种核蛋白（NAPs）。NAPs和基因转录活性可以改变拟核的形态结构，相对而言，质粒DNA较为简单，以共价闭环（cccDNA）形式游离于细胞质中。
常用质粒提取方法
Method
目前常用的质粒提取方法包括碱裂解法、煮沸法和去污剂裂解法。前两种方法较为剧烈，适用于较小的质粒（<15Kb），而去污剂裂解法较为温和，适用于较大分子量的质粒（>15Kb）。
碱裂解法
碱裂解法是较为广泛的质粒DNA提取方法，基于共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑结构差异进行分离。其步骤如下：
1）碱裂解与细胞破裂
在强碱性环境（pH 12.0-12.6）下，细菌的细胞壁和细胞膜被十二烷基硫酸钠（SDS）破坏，基因组DNA和质粒DNA被释放。
染色体及线性DNA双螺旋结构在高碱性条件下发生变性，而质粒DNA由于结构紧密，不易变性。
2） 中和与复性
将溶液的pH调至中性，共价闭合环状质粒DNA能够快速复性，恢复其天然结构。
线性基因组DNA复性缓慢，与蛋白质及细胞碎片缠绕形成不溶性复合物，沉淀下来。
3）沉淀与分离
在高盐条件下（例如，使用钾离子代替钠离子），细胞碎片、变性蛋白质和线性基因组DNA沉淀，质粒DNA则保持可溶状态。
经过离心，去除沉淀物，上清液中的质粒DNA可通过乙醇沉淀或硅胶膜特异性吸附等方法进一步纯化。
主要试剂成分及作用
Composition and Function
在没有质粒提取试剂盒之前，大多提取质粒都是自己配置试剂来提取大肠杆菌中的质粒，主要用到以下三个试剂：
溶菌液
葡萄糖：增加溶液粘度，维持渗透压，防止DNA因机械剪切力作用而降解。
EDTA：螯合Mg⊃2;⁺、Ca⊃2;⁺等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解作用，同时有助于溶菌酶的作用。
NaOH-SDS液
NaOH：核酸在pH＞5，＜9的溶液中稳定，但在pH＞12或＜3时会引起双链之间氢键的解离而变性。
SDS：SDS是离子型表面活性剂，主要功能有：1、溶解细胞膜上的脂质和蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；2、解聚细胞中的核蛋白；3、SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-....R+-蛋白质的复合物，使得蛋白质变性而沉淀下来。
3mol/L NaAc（pH4.8）溶液
该溶液为NaAc-HAc缓冲液，调节抽提液pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性并稳定存在。
高盐的3mol/L的NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀之。
