简体中文

信息中心

首页 » 资讯 » 干货分享|WB只有注意细节才会更漂亮!

干货分享|WB只有注意细节才会更漂亮!

浏览数量: 0     作者: 本站编辑     发布时间: 2024-05-15      来源: 本站

干货分享|WB只有注意细节才会更漂亮!

只有做过WB的人才会知道WB有多容易翻车!!!“科研生涯走过最长的路,就是WB实验的弯路...”,我想把自己总结的一些经验分享给大家。


#01-制样

1. 为确保样本蛋白质免于降解,采取取材后立即于液氮环境下实施快速冷冻处理,随后贮存于-80℃恒温冷柜中。在此过程中,务必配置与之对应批次的阳性对照样本

2. 研磨组织:研磨充分,根据重量加裂解液(1:10)超声1min,置于冰上裂解30min。

裂解后:①观察裂解液是否粘稠,粘稠原因可能是没打超声,或者是裂解液量不够,需要补加裂解液;

②离心后观察上清是否澄清,下面是否有白色沉淀,如果比较大块的话也是没有裂解好。较软组织称重后按比例加入裂解液,使用手持研磨仪研磨,较韧组织使用液氮低温研磨。

3. 进行蛋白定量时,推荐采用BCA( bicinchoninic acid assay)法。在进行BCA测定前,应对蛋白原液进行充分涡旋混匀,以确保样本均匀性。取样时,应选取管中部的液体进行检测,以代表整体蛋白浓度。此外,为提高测定的准确性和可信度,务必设置重复孔(复孔)进行平行测量。

4. 配置体系:按照蛋白原液的量来配置体系,配置前一定要看清组别和体积,精力需集中,防止加错,配置后涡旋,煮样,记得要把样本加到液面下,不要滴在盖子。

5. 制备好的样品暂不使用时,立即放入-20℃冰箱保存。

微信图片_20240515095209

#02-电泳

1. 电泳液混匀后使用,液面过短玻板,建议用新液,严防槽漏。

2. 提前制胶时玻璃板一定要洗净,否侧会影响你的电泳哦。配胶的时候一定要充分混匀,(可以适当超声一下,不要太久),加完分离胶后可以加入纯化水等压平分离胶,这样分离胶就会凝成一条直线(这个我觉得很重要),胶凝得不好,后面跑出的条带会很丑。

3. 一般跑20min左右溴酚蓝会被压成一条直线,前20 分钟一定要观察,如果发现溴酚蓝跑歪了,及时暂停检查内槽是否漏液、盖子是否盖好,前20min还能拯救一下的。

4. 电泳期间观察是否有发热现象。

5. 上样前涡旋相同次数,记得设置同批次的阳性对照。

6. 上样时缓慢一点,尽量让每个孔内样本时水平升起,不要在孔的左右角用力加样,否则会因为胶孔不均出现哑铃条带。

7. 煮好的样本-20℃拿出来后,上样前使用变形温度煮3min,更加稳定。

图片


#03-电转


1. 三明治结构夹紧,滤纸起毛之后及时更换,显影后出现两边重,中间浅,可能是转膜夹子太紧,或者不平整导致的。

2. 电转液浑浊后换新的。

3. 安装夹子的时候需小心,否则膜可能会移位,导致蛋白丢失。

4. 电泳期间要冰水浴,盒内也要加冰盒或者冰块(建议加冰块),防止发热,过热会损伤

5. 蛋白。

微信图片_20240515095218

#04-封闭及孵育


1. 封闭时间2h左右适宜,时间过少会导致非特异性结合位点多,背景脏;时间过长,信号低。

2. 孵育磷酸化的蛋白时,推荐使用2%BSA,脱脂牛奶可能会导致信号丢失。

3. 一抗的孵育时间16-24h,过短可能会导致抗原抗体结合不充分从而致使信号丢失。

4. 洗膜,短时间多次,勤换TBST,若洗脱效果不好,可以多加一点Tween20.

5. 所有液体不要直接冲到膜上,从容器的边缘加,或者慢慢从膜的边缘加。

微信图片_20240515095222


#05-曝光


1. 快速滴加发光液后反过来,,进行20-30s的孵育,再进行曝光,会均匀很多。

2. 如果条带信号较低,使用灵敏度较高的发光液、延长曝光。考虑:封闭过度、提高一抗浓度、孵育时间、二抗浓度提高。

3. 如果出现黑一块白一块的现象,发光液不均匀导致的

微信图片_20240515095227
Western blotting充满了未知与挑战,每一步都暗藏着深深的“坑”,只有对细节的极致追求,才能铺就成功的道路。让我们这些科研小伙伴们,一同跃过这些险阻,展现出非常完美的条带!愿每一次实验都能如你所愿,收获满满的成果与喜悦!


微信图片_20240515095159

成为让您最值得信赖的⽣命科学耗材供应商,

我们在路上。

快速链接

类别

联系我们
版权所有 © 2021 杭州爱津生物技术有限公司    技术支持  领动    网站地图   浙ICP备11063289号-1