浏览数量： 0 作者： 本站编辑 发布时间： 2024-05-15 来源： 本站
只有做过WB的人才会知道WB有多容易翻车！！！“科研生涯走过最长的路，就是WB实验的弯路...”，我想把自己总结的一些经验分享给大家。
#01-制样
1. 为确保样本蛋白质免于降解，采取取材后立即于液氮环境下实施快速冷冻处理，随后贮存于-80℃恒温冷柜中。在此过程中，务必配置与之对应批次的阳性对照样本
2. 研磨组织：研磨充分，根据重量加裂解液（1:10）超声1min，置于冰上裂解30min。
裂解后：①观察裂解液是否粘稠，粘稠原因可能是没打超声，或者是裂解液量不够，需要补加裂解液；
②离心后观察上清是否澄清，下面是否有白色沉淀，如果比较大块的话也是没有裂解好。较软组织称重后按比例加入裂解液，使用手持研磨仪研磨，较韧组织使用液氮低温研磨。
3. 进行蛋白定量时，推荐采用BCA（ bicinchoninic acid assay）法。在进行BCA测定前，应对蛋白原液进行充分涡旋混匀，以确保样本均匀性。取样时，应选取管中部的液体进行检测，以代表整体蛋白浓度。此外，为提高测定的准确性和可信度，务必设置重复孔（复孔）进行平行测量。
4. 配置体系：按照蛋白原液的量来配置体系，配置前一定要看清组别和体积，精力需集中，防止加错，配置后涡旋，煮样，记得要把样本加到液面下，不要滴在盖子。
5. 制备好的样品暂不使用时，立即放入-20℃冰箱保存。
#02-电泳
1. 电泳液混匀后使用，液面过短玻板，建议用新液，严防槽漏。
2. 提前制胶时玻璃板一定要洗净，否侧会影响你的电泳哦。配胶的时候一定要充分混匀，（可以适当超声一下，不要太久），加完分离胶后可以加入纯化水等压平分离胶，这样分离胶就会凝成一条直线（这个我觉得很重要），胶凝得不好，后面跑出的条带会很丑。
3. 一般跑20min左右溴酚蓝会被压成一条直线，前20 分钟一定要观察，如果发现溴酚蓝跑歪了，及时暂停检查内槽是否漏液、盖子是否盖好，前20min还能拯救一下的。
4. 电泳期间观察是否有发热现象。
5. 上样前涡旋相同次数，记得设置同批次的阳性对照。
6. 上样时缓慢一点，尽量让每个孔内样本时水平升起，不要在孔的左右角用力加样，否则会因为胶孔不均出现哑铃条带。
7. 煮好的样本-20℃拿出来后，上样前使用变形温度煮3min，更加稳定。
#03-电转
1. 三明治结构夹紧，滤纸起毛之后及时更换，显影后出现两边重，中间浅，可能是转膜夹子太紧，或者不平整导致的。
2. 电转液浑浊后换新的。
3. 安装夹子的时候需小心，否则膜可能会移位，导致蛋白丢失。
4. 电泳期间要冰水浴，盒内也要加冰盒或者冰块（建议加冰块），防止发热，过热会损伤
5. 蛋白。
#04-封闭及孵育
1. 封闭时间2h左右适宜，时间过少会导致非特异性结合位点多，背景脏；时间过长，信号低。
2. 孵育磷酸化的蛋白时，推荐使用2%BSA，脱脂牛奶可能会导致信号丢失。
3. 一抗的孵育时间16-24h，过短可能会导致抗原抗体结合不充分从而致使信号丢失。
4. 洗膜，短时间多次，勤换TBST，若洗脱效果不好，可以多加一点Tween20.
5. 所有液体不要直接冲到膜上，从容器的边缘加，或者慢慢从膜的边缘加。
#05-曝光
2. 如果条带信号较低，使用灵敏度较高的发光液、延长曝光。考虑：封闭过度、提高一抗浓度、孵育时间、二抗浓度提高。
3. 如果出现黑一块白一块的现象，发光液不均匀导致的
